Chromozomy

18.11.2015 16:25

• jádro lidské buňky průměr asi 5-8 mikrometrů × DNA v jádře dlouhá 2 metry → DNA velmi sbalena – tak, že může interagovat s enzymy + dalšími proteiny nutnými pro transkripci, replikaci a reparaci
• chromosom se skládá z 1 dlouhé lineární molekuly DNA, na které jsou navázány proteiny → svinutí do kompaktnější struktury
• zdvojený chromosom – má 2 chromatidy (každá chromatida = 1 vlákno DNA)
• komplex DNA a proteinů = chromatin (chroma = barva → barvitelný)
  • proteiny napomáhají sbalení + podílejí se na genové expresi, replikaci a reparaci DNA
• u člověka všechny somatické buňky obsahují 2 kopie každého chromosomu 1 páru = homologní chromosomy
  × jediný nehomologní pár – pohlavní chromosomy X a Y

STAVBA CHROMOSOMU

• chromatida – krátké (p-) raménko a dlouhé (q-) raménko
• telomery na koncích (repetitivní sekvence)
• centromera (repetitivní sekvence)
  + kinetochory = proteinové struktury; při mitóze se na ně připojují kinetochorová vlákna (~ mikrotubuly); pokud poškozeny či chybí → chromosom se při mitóze ztrácí a vznikají aneuploidní buňky

 

TYPY CHROMOSOMŮ

• autozom
  • nepohlavní chromosom
  • u člověka v klasické tělní buňce 22 párů
  • autozomální dědičnost = dědičnost genů ležících na autozomech
• gonozom
  • pohlavní chromosom
  • sestava gonozomů se liší dle pohlaví a typu určení pohlaví (člověk – X a Y)
  • gonozomální dědičnost = dědičnost genů ležících v nehomologní části gonozomů
• homologické (homologní) chromosomy
  • chromosomy 1 páru
  • mají shodnou velikost, polohu centromery, stejný obsah genů (ne alel!)
  • stejným způsobem se barví, párují se při meióze – tvoří bivalenty
    • párování zajišťuje synaptický komplex – proteinová struktura (2 laterální elementy spojeny příčnými vlákny s centrálním elementem; na obvodu spiralizované vlákno obou chromosomů)
    • na bivalentech dochází k procesu crossing-over, jehož důsledkem je rekombinace částí chromatid; místa překřížení = chiazmata
• metacentrický (mediocentrický) chromosom
  • p- a q-raménko stejně dlouhé, centromera uprostřed chromosomu
  • může vzniknout při mutaci translokací 2 akrocentrických chromosomů (Robertsonovská translokace)
• submetacentrický (submediocentrický) chromosom
  • krátké (p-) a dlouhé (q-) raménko, centromera není uprostřed chromosomu
• akrocentrický chromosom
  • místo p-raménka satelit (distální segment chromozomu oddělený od vlastního chromozomu úzkou částí nazývanou sekundární konstrikce), centromera téměř na konci chromosomu
• telocentrický chromosom
  • p-raménko chybí, centromera na konci chromosomu
• acentrický chromosom
  • chromosom, který ztratil centromeru
• holocentrický chromosom
  • chromosom, u kterého není centromera lokalizována do 1 místa, ale centromerická aktivita je rozptýlena po celém chromosomu = celý chromosom je centromerou
  • nelze rozlišit raménka
  • při mitóze se připojuje k vláknům dělicího vřeténka po celé své délce; pokud se rozpadne na více menších částí, každý z fragmentů si zachovává schopnost aktivně se připojit k dělicímu vřeténku
  • pouze u některých organismů: u rostlin čeledi Juncaceae (sítiny) a Cyperaceae (šáchorovité –ostřice), u živočichů hlísti a pavoukovci
•  
  polyténní chromosom
  • chromosom, na kterém došlo k několikanásobné replikaci, ale nedošlo k následnému rozpadu na jednotlivé chromatidy (jednochromatidovéchromosomy)
  • ideální model pro studium strukturních aberací (obrovské, snadno pozorovatelné)
• feminizující X* chromosom
  • chromosom, který podmiňuje vznik samičího pohlaví
  • XX ♀, X*X ♀, X*Y ♀, XY ♂ – způsobuje převahu samic
  • samice X*Y mají potomky X*X : X*Y : XY : YY (neživotaschopní) v poměru 1 : 1 : 1 : 1
  • vyskytuje se u lumíka velkého

• stav chromosomů se mění během buněčného cyklu

  • chromosomy obvykle rozvolněné (dlouhá, tenká, vzájemně propletená vlákna)
    × kondenzované jen v malé části buněčného cyklu
  • vysoce kondenzované chromosomy v dělících se buňkách (při mitóze) = mitotické chromosomy
    × rozvolněnější chromosomy = interfázové (interfázní) chromosomy
  • kondenzovaný stav důležitý při snadném oddělení zduplikovaných chromosomů (asistence mitotického vřeténka)
  • vysoce kondenzované chromosomy také při meióze

   

  specializované sekvence DNA zajišťují  účinnou replikaci chromosomů

  • chromosomy fungují jako samostatné strukturní jednotky → každý se musí samostatně zreplikovat,…
    → to kontrolují 3 typy specializovaných sekvencí:
    • replikační počátky
      • začátek duplikace DNA
      • většina chromosomů obsahuje více počátků → zrychlení replikace
  • • centromery
      • zajišťují rozchod replikovaných chromosomů do dceřiných buněk při mitóze – na centromerách proteinové komplexy = kinetochory – ty váží chromosomy na dělícívřeténko a umožňují tak oddělit se od sebe
  • • telomery
      • na obou koncích chromosomu
      • obsahují repetitivní sekvence, které umožňují replikaci konců chromosomů – DNA-polymeráza může syntetizovat DNA jen ve směru 5′→3′ → problém při opožďujícím seřetězci – primery nemohou vzniknout na úplném konci chromosomu → při každé replikaci by docházelo ke ztrátám koncových oblastí
      • enzym telomeráza (reverzní transkriptáza) – přidává mnoho kopií stejné sekvence (má vlastní RNA komplementární k repetitivní sekvenci DNA) → vznikne templát prodosyntetizování opožďujícího řetězce
      • telomeráza funguje jen v embryonálním vývoji (pak je její funkce blokována) → po narození a během života již nepracuje → telomery se při každém buněčném dělenízkracují, až dosáhnou určité délky, kdy se buňka přestává dělit → 1 z příčin stárnutí
        • u člověka telomery dlouhé na 50-60 dělení (Hayflickův limit: Hayflick L., Moorhead P.S. (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains. ExperimentalCell Research, 25:585-621) × pro postavení našeho těla stačí mnohem méně + asi 20 % se využije pro regeneraci
        • pojistka proti nádorům
        • pokus: myši odebrány geny pro telomerázu → nestalo se jí nic, pouze měla kratší telomery → až v 7. generaci zkráceny natolik, že byl problém v tkáních, kterése rychle obnovují (střevní epitel)
        • Nobelova cena za objevení telomerázy (2009) – Jack W. Szostak
  • • další funkce telomer: repetice telomerázových sekvencí a přilehlé oblasti vytvoří strukturu, která chrání chromosom před DNA-nukleázami (ty přednostně degradujíkonce molekul DNA)

   

  CHROMATIN = komplex DNA a proteinů

  • dle fáze buněčného cyklu se mění jeho stav
    • v interfázi rozvolněný → umožňuje přístup proteinů potřebných pro expresi genů/replikaci
    • před vstupem do mitózy další postupné sbalování chromatinu → vzniknou vysoce kondenzované mitotické chromosomy – zde již zreplikovaná DNA + transkripce zastavena
      → kontrola genové exprese

  epigenetika 

  • • tzv. chromatinová dědičnost → strukturní i chemické modifikace chromatinu (ne změny v sekvenci nukleotidů!) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace
    • velké změny v epigenetické úpravě chromatinu hlavně v embryonálním vývoji, pubertě a při stárnutí; mladí jedinci zpravidla rezistentní; v průběhu ontogeneze epigenetické změny reverzibilní
    • např. genomový imprinting (též parentální, gametický)
      • imprintovaná alela = methylovaná alela (navázání –CH₃) = neaktivní alela
        → nemá fenotypový projev → pokud heterozygot a methylovaná alela je dominantní, neprojeví se a fenotyp závisí na recesivní alele (tento heterozygot se pak chová jako recesivní homozygot)
      • např. alela A pro červenou barvu a alela a pro bílou barvu květů
        → normálně heterozygot Aa červené květy × pokud alela A imprintovaná, heterozygot Aa má bílé květ
      • záleží, od kterého rodiče imprintovaná alela zděděna
        • maternální imprinting (od matky), paternální imprinting (od otce)

   

  nukleosom

  • nukleosomové jádro + sousední spojovací úsek DNA
  • základní jednotka kondenzace chromatinu
  • objevení struktury: naštěpení rozvinutého chromatinu specifickou nukleázou → rozštěpila DNA mezi jednotlivými nukleosomy (ne úplně na jednotlivé nukleotidy)
  • jádro nukleosomu: komplex 8 histonů = histonový oktamer
    • histony H2A, H2B, H3, H4 (každý po 2 molekulách)
      + dvouřetězcová DNA o délce 146 nukleotidových párů
  • DNA obtočena kolem oktameru 1,45x – tak se zkrátí až na 1/3 své původní délky
  • histony = malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých AK (lysin, arginin) → pevné navázání histonů na záporně nabité fosfátové skupiny DNA (bez ohledu na sekvenci)
    • v buňce kolem 60 mil. molekul od každého typu! – evolučně nejvíce konzervované proteiny u eukaryot → nezbytné při formování chromatinu
    • N-konce cílem posttranslačních modifikací (trčí ven z nukleosomů) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace → modifikace vedou ke změnám vazby histonů na DNA – rozvolňují/kompaktují strukturu
  • nukleosomy od sebe vzdálené asi 200 nukleotidových párů (146 omotáno kolem jádra nukleosomu, zbytek asi 50 spojuje sousední jádra)
  • nukleosomy nebrzdí RNA-polymerázu při transkripci, nejsou překážkou ani při replikaci – dochází jen k reorganizaci nukleosomových proteinů

  STRUKTURA CHROMOSOMU (spiralizace)

  • několik úrovní:
    • „korálková“ forma chromatinu (10 nm) – jen velmi zřídka
    • 30nmetrové vlákno (30 nm)
      • nukleosomy těsně přiloženy k sobě → kompaktnější struktura
      • histon H1 – drží sousední nukleosomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání
      • rozvolněný chromosom nejčastěji v tomto stavu
    • smyčky připojené k centrální ose – odstupují směrem ven (= průměr chromosomu 700 nm)
    • celkový chromosom (1400 nm)

  • vysoká kondenzace → zablokování transkripce (RNA-polymeráza a ostatní proteiny se nemohou vázat na DNA)
  • stupeň spiralizace jednotlivých oblastí DNA závisí také na její aktuální aktivitě

   

  INTERFÁZOVÉ CHROMOSOMY

  • po mitóze se chromosomy rozvolňují (dekondenzují)
    × ne ve všech oblastech chromosomu stejně – v rámci 1 chromosomu se mohou vyskytovat všechny stupně kondenzace (transkribované oblasti rozvolněnější, nepřepisované kondenzovanější)
  • jednotlivé chromosomy se liší v různých buněčných typech (v závislosti na tom, které geny jsou přepisovány)

heterochromatin

• nejvíce kondenzovaná forma chromatinu (heteros = odlišný)
• silně se barvící oblasti chromatinu
• > 10 % interfázových chromosomů, hl. v okolí centromer a telomer
• transkripčně inaktivní
• konstitutivní (nikdy se nepřepisuje) a fakultativní (přepisuje se jen za určitých podmínek)
• pokud se normální geny dostanou do heterochromatinové oblasti, inaktivují se
  • polohový efekt – např. gen white (Drosophila), gen ADE2 (kvasinka)
• typický příklad: inaktivace 1 z chromosomů X u samic savců
  • dvojnásobné množství produktů X chromosomu by bylo letální → 1 chromosom X (od otce nebo od matky) trvale inaktivován – na začátku embryonálního vývoje, kondenzace náhodná (v dalších buněčných generacích pak kondenzován vždy stejný X chromosom)
  • poměr inaktivovaných a aktivovaných X chromosomů od otce a od matky je zhruba 1 : 1 (důkaz náhodnosti procesu) – výjimka jen vačnatci, tam vždy inaktivován X od otce

euchromatin

• zbytek v různém stupni kondenzace (eu = pravý, normální)
• v typické diferencované eukaryotní buňce asi 10 % chromatinu aktivně přepisováno nebo ve stavu snadno přístupném transkripci
• aktivní chromatin
• špatně barvitelný

FISH (fluorescent in situ hybridization)

• • umožňuje lokalizovat geny nebo jinou specifickou DNA přímo na cytogenetickém preparátu
  • sonda (angl. probe) – značená fluorescenčně – váže se ke komplementárnímu úseku na denaturovanémchromosomu
  • známe sekvenci DNA, jejíž poloha nás zajímá na chromosomu → označíme úsek komplementární ke genu, na kterém je navázána fluorescenční molekula (sonda) → denaturace DNA i sondy → renaturace → spojí se vlákno sondy a původní DNA → svítí jen část chromosomu s komplementární sekvencí
  • typy sond:
    • satelitní – centromerické, telomerické, Y-heterochromatinová
    • lokus-specifické („genové“)
    • malovací – celochromosomové, hybridizující s částmi chromosomů
    • při vizualizaci často kombinace více typů sond (např. lokus-specifická pro lokus SRY na Y chromosomu a centromerická)
  • SKY (spectral karyotyping) – každý chromosom specifický odstín, detekce chromosomových aberací – hlavnětranslokace)

 

METODA BUNĚČNÉ HYBRIDIZACE

• používá se pro přiřazení lidských genů k chromosomům
• využití mezidruhové hybridizace mezi myšími a lidskými buňkami
  • fúze myší a lidské buňky vhodných genotypů → vzniká hybridní buňka obsahující myší i lidské chromosomy
  • selekce produktů fúze na vhodném médiu (HAT médium – živiny + hypoxantin + aminopterin + thymidin) – přežijí jen hybridi
  • cytogenetická a biochemická, popř. imunologická, analýza hybridních klonů
• charakteristickým rysem je nestabilita a postupné (náhodné) vytrácení lidských chromosomů → dospěje se ke stabilní linii jen s několika lidskými chromosomy
• zjišťuje se, který gen mají linie společný a také které chromosomy → podle toho se určí, na kterém chromosomu gen leží